Медицинские диагностические препараты
Содержание
Введение
1. Общая характеристика диагностических препаратов
2. Диагностические сыворотки
2.1 Агглютинирующие сыворотки и технология их приготовления
2.2 Преципитирующие сыворотки и технология их приготовления
2.3 Антитоксические сыворотки и технология их приготовления
2.4 Диагностические сыворотки для постановки реакции связывания комплемента и технология их приготовления
2.5 Флуоресцирующие диагностические сыворотки
2.6 Контроль диагностических сывороток
3. Антигены-диагностикумы. Контроль диагностических стандартных антигенов
4. Особенности приготовления вирусных диагностикумов
5. Общая характеристика бактериофагов
6. Аллергены, технология их приготовления. Контроль аллергенов
7. Моноклональные антитела
8. Молекулярная диагностика
8.1 Методы иммунодиагностики
9. Системы ДНК-диагностики
9.1 Гибридизационные зонды
9.2 Нерадиоактивные методы детекции
10. Биосенсорные устройства для медицинской диагностики
Заключение
Список использованных источников
Введение
Эпидемическая обстановка в мире никогда не была спокойной. Все время наблюдались вспышки инфекционных заболеваний и появлялись новые виды заразных болезней, а в последние 10 лет происходит возвращение «старых» инфекций. Генетическая изменчивость циркулирующих штаммов, внутрибольничные инфекции, бактерионосительство, трудности в обеспечении и применении иммунобиологических препаратов требуют усиления работы в области иммунопрофилактики и иммунотерапии. Недостаточное внимание к этим проблемам неминуемо приводит к подъему инфекционной заболеваемости.
Профилактика и лечение, основанные на иммунологических принципах, стали решающим средством снижения детской смертности, увеличения продолжительности и улучшения качества жизни всех возрастных групп населения.
Хорошо известно, что профилактика является самым эффективным и самым экономичным способом сохранения здоровья людей.
Люди научились бороться с инфекциями, однако их иммунная система стала слабее реагировать на патогены и не всегда справляется с инфекционными заболеваниями.
Для иммунопрофилактики и иммунотерапии особенно важны вопросы этики и морали. Этические проблемы возникают при производстве, испытаниях и практическом использовании препаратов. К сожалению, многие этические проблемы иммунопрофилактики и иммунотерапии решаются крайне медленно. Прежде всего, это касается вопросов взаимодействия медицинского персонала и населения, связи медицинских учреждений с родителями и средствами массовой информации.
1. Общая характеристика диагностических препаратов
Диагностические препараты относятся к иммунобиологическим препаратам, поскольку их действие основано на иммунологических принципах и реакциях. Диагностические препараты, системы и наборы широко используют для диагностики инфекционных и неинфекционных болезней, индикации и идентификации бактерий, вирусов, грибов и простейших, для определения иммунного статуса, аллергических и иммунопатологических расстройств, иммунологической совместимости тканей, иммунных взаимоотношений матери и плода и т.д.
Диагностикумы применяют для выявления специфических антигенов и антител, аллергенов, сенсибилизированных иммунокомпетентных клеток, факторов естественной резистентности, иммунорегуляторов. В соответствии с целевым назначением диагностических препаратов они содержат те или иные специфические иммунореагенты (антигены, антитела, аллергены, иммуномодуляторы, факторы естественного иммунитета и др.), которые используют для выявления объекта исследования в определенных реакциях или тест-системах. Эффект реакции в соответствии с характером иммунореагентов и механизма реакции регистрируют по физическим (например, мутность), химическим (например, изменение цветности) или клиническим (симптомы и проявления) показателям.
На основе перечисленных иммунологических реакций созданы сотни современных диагностических систем, с помощью которых диагностируют инфекционные (ВИЧ-инфекции, грипп, брюшной тиф, чума, холера, хламидиоз, вирусные гепатиты и др.) и неинфекционные (онкологические, аллергические, иммунопатологические и др.) болезни. Иммунологические методы диагностики специфичны, высокочувствительны и достоверны, поэтому находят широкое применение в медицине и экологии. [7]
2. Диагностические сыворотки
К диагностическим специфическим сывороткам, применяемым для обнаружения в тех или иных материалах антигенов или для определения вида и даже типа микроба или вируса, относятся агглютинирующие, преципитирующие и лизирующие (комплементсвязывающие). Такая классификация основана на функциональной способности специфических гамма-глобулинов склеивать (агглютинировать), осаждать (преципитировать), растворять (лизировать) соответствующие антигены.
2.1 Агглютинирующие сыворотки и технология их приготовления
Явление агглютинации впервые выявили Шарен и Роже в 1889 году. Однако только через несколько лет этому феномену было придано диагностическое значение. В 1896 году Грубер и Дургам установили возможность использования реакции агглютинации (РА) для определения вида микробов, выделенными от больных людей кишечными инфекциями. Указанные авторы, а также, в последующем Видаль (Widal F., 1896) и Грюнбаум (Grunbaurn A., I897) предложили использовать агглютинирующую способность сывороток крови больных для диагностики брюшного тифа, Вейль и Феликс -- для диагностики сыпного тифа, Раит -- для диагностики бруцеллеза, и другие.
Уже в первые годы после обнаружения феномена агглютинации в лабораторной практике наметились два направления его использования: определение по заведомо известным иммунным сывороткам вида выделенного микроба и обнаружение в исследуемых сыворотках крови больных специфических антител (агглютининов) с помощью известных стандартных антигенов (взвеси убитых микробов). Кроме того, было установлено, что не все виды микроорганизмов способны вызывать образование агглютининов в достаточно большом количестве. Например, микробы, образующие на плотных питательных средах колонии шероховатой формы, не образуют гомогенную суспензию, поэтому они как антигены не могут быть использованы в реакции агглютинации (возбудители сибирской язвы, туберкулеза, некоторые виды стрептококков и другие).
Наиболее широко агглютинирующие сыворотки применяют при дифференциации микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae, рода Brucella, Listeria, возбудителей риккетсиозных и вирусных инфекций.
Агглютинирующие сыворотки готовят путем гипериммунизации животных различными корпускулярными антигенами, введением их парентеральным путем. В качестве антигенов используют живые или убитые различными способами культуры соответствующих микробов. В связи с непостоянным содержанием антигенных компонентов у одного и того же вида бактерий желательно животных иммунизировать несколькими штаммами (2--3) этого вида микроба. Для получения поливалентных агглютинирующих сывороток прибегают к одновременному введению смеси антигенов из нескольких типов бактерий одного и того же вида. В процессе работы необходимо следить за однородностью популяции штамма, используемого для иммунизации. Лучшим способом сохранения агглютиногенных свойств является лиофильное высушивание.
В большинстве случаев для получения полноценных агглютинирующих сывороток используют в качестве антигенов культуры микробов в S-форме. Реже требуются О- или R-варианты. Для получения сывороток лучше использовать в качестве антигенов живые культуры бактерий или вирусов, в ряде случаев для иммунизации животных использовать вновь пересеянные (суточные) культуры микробов.
С целью изготовления антигенов соответствующие микробы выращивают на плотных питательных средах. Если это сальмонеллы или эшерихии, то микробный газон смывают физиологическим раствором через 18--20 часов культивирования при 37°С. Для бруцелл, туляремийных бактерий сроки культивирования составляют 48--72 часа, для лептоспир -- 8--10 суток.
В ряде случаев введение живых культур может вызывать тяжелую реакцию организма иммунизируемых животных, и даже их гибель. Поэтому, где это допустимо, животных иммунизируют убитыми взвесями микроорганизмов.
При получении агглютинирующих сывороток необходимо иметь в виду, что микробная клетка имеет очень сложную антигенную структуру. Она состоит из могочисленных антигенов, расположенных в различных местах тела клетки (соматические О- и К-антигены) и в ее жгутиковом аппарате (Н-антигены).
О-антиген термостабилен, он создает медленно выпадающую зернистую или комковатую агглютинацию, трудно разбивающуюся при встряхивании. О-агглютинирующие сыворотки склеивают микробные клетки по полюсам. При этом подвижность у таких микробов не утрачивается (например, у лептоспир и других подвижных микробов).
К-антигены располагаются в теле микробной клетки наиболее поверхностно и полностью прикрывают собой О-антигены. Это и объясняет инагглютинабильность культур, имеющих К-антигены. К-антигены термолабильны и состоят из нескольких фракций (Vi, В, L, А). Микробные клетки при К-агглютинации склеиваются между собой всей соприкасающейся поверхностью. Считают, что глубинные соматические или О-антигены проявляются в реакции агглютинации лишь у диссоциированных штаммов, находящихся в R-форме.
У подвижных жгутиковых микробов имеются Н-антигены. Они термолабильны и образуют с сыворотками крупный хлопьевидный осадок. Н-агглютинирующие сыворотки склеивают бактерии жгутиками, поэтому они становятся неподвижными.
Все указанные микробные антигены отличаются по химической природе, и поэтому они неодинаково чувствительны к действию температуры и химических веществ. Например, если О-антиген не разрушается при кипячении, автоклавировании и при воздействии спирта, ацетона, то Н-антигены разрушаются при 2,5-часовом кипячении и при обработке спиртом. Vi-антигены сальмонелл разрушаются при кипячении мгновенно, а при 60° С в течение 30 минут.
В тоже время поверхностные О- и К-антигены, а также жгутиковые Н-антигены относительно устойчивы к формалину, что широко используется при приготовлении формолвакцин.
Для получения диагностических агглютинирующих сывороток чаще всего используют кроликов. Иммунизацию в большинстве случаев проводят внутривенным способом в нарастающих дозах и интервалами в 4 суток. Обычно производят 3--4 инъекции анти гена.
Подкожный метод введения антигена применяют обычно для первичного введения в случае повышенной его токсичности. Пробное взятие крови с целью установления титров агглютининов проводят через 6--7 суток после последнего введения антигена. Следовательно, весь цикл иммунизации длится около месяца.
Примером получения диагностических сывороток может служить приготовление агглютинирующих О-коли-сывороток. В качестве продуцентов используют кроликов породы шиншилла весом 3--4 кг в возрасте 6--12 месяцев. После закупки здоровых кроликов выдерживают в карантине не менее 3--4 недель для исключения инфекционных заболеваний и адаптации к условиям фабрики. В качестве антигенов используют смывы физраствором агаровых 18--20-часовых культур соответствующих серовариантов эшерихий и подвергнутых кипячению или автоклавированшо в течение 2--2,5 часа. При этом каждый антиген готовится впрок в количестве, не обходимом на весь цикл гипериммунизации, и хранится в холодильнике при 4--5° С не более 30 суток. Антиген в концентрации 2 млрд микробных тел в 1 мл вводится кроликам в краевую ушную вену с интервалом в 3--5 суток в дозах 0,3; 0,6; 1,0; 2,0; 3,0 мл. Через 5--6 суток после последнего введения антигена у каждого кролика определяют титры антител. Ежели они соответствуют инструктивным требованиям, то от кроликов берут тотальным способом кровь, отстаивают сыворотку, консервируют борной кислотой, отстаивают не менее двух месяцев при температуре 4--5° С, после чего фильтруют через стерилизующие пластины или мембранные фильтры, проверяют на стерильность, разливают в ампулы и подвергают лиофильной сушке. Затем ампулы запаивают под вакуумом и сыворотки подвергают контролю, по внешнему виду, наличию, вакуума, содержанию влаги, растворимости, активности, и специфичности.
С целью получения О-сывороток иммунизируют кроликов внутривенно прокипяченными или спиртовыми антигенами соответствующих серотипов сальмонелл. Для получения Н-сывороток кроликов иммунизируют формалинизированными антигенами, используя по возможности культуры в однофазном состоянии по Н-антигену.
Диагностические агглютинирующие сыворотки готовятся к лептоспирам, листериям, бруцеллам, кампилобактериям и другим микроорганизмам. Технология их изготовления аналогична описанным с учетом отдельных, особенностей в каждом конкретном случае, что регламентируется соответствующими инструкциями. [4, 16, 21]
2.2 Преципитирующие сыворотки и технология их приготовления
Преципитирующие сыворотки предпочтительно готовят для диагностики сибирской язвы. Первыми для этих целей получили преципитирующую сыворотку Асколи и Валенти в 1910 году. Они иммунизировали внутривенным способом лошадей слабовирулентной культурой возбудителя сибирской язвы. В последующие годы методы получения качественных сывороток совершенствовались. В настоящее время в нашей стране преципитирующую сибиреязвенную сыворотку получают путем внутривенной иммунизации лошадей слабовирулентными штаммами 916-1, 111-15, 94 и штаммом из матрикса второй вакцины Ценковского. Указанные штаммы выращиваются на гороховом агаре в течение 18--20 часов при 36--37° С. Культуры соответствующих штаммов смывают с поверхности горохового агара физиологическим раствором, тщательно шуттелируют, фильтруют и стандартизируют. Лошадей гипериммунизируют поочередным введением каждого из указанных штаммов внутривенно. Всего делают 16--17 инъекций антигена, увеличивая дозу с 5 до 70 мл. В период гипериммунизации делают контрольные исследования на накопление антител. По окончании гипериммунизации кровь от лошадей берут через 9--16 суток после последнего введения антигена из расчета 800 мл на 50 кг массы животного. Из крови получают сыворотку методом ее нитрирования с последующим сепарированием и дефибринизацией плазмы. Сыворотку консервируют 0,5%-м раствором фенола. Затем сыворотку выдерживают в специальных отстойниках в течение двух месяцев, после чего подвергают ее стерилизующей фильтрации, разливают во флаконы емкостью 50--100 см3, закрывают их резиновыми пробками и обкатывают алюминиевыми колпачками. После этого препарат подвергается биологическому контролю.
Следует отметить, что совершенствование получения наиболее качественных преципитирующих сибиреязвенных сывороток продолжается, так, установлено, что в ряде случаев они обладают неспецифичными свойствами и дают положительные реакции преципитации с термостабильными антигенами из Вас. megaterium и Вас. anthracoides (Митин С. С, Кретинина А. И., Петрова Л. А., 1996). Преципитирующие сибиреязвенные сыворотки применяют для проверки кожевенного сырья на сибирскую язву, а также при исследовании на сибирскую язву патологического материала, особенно из загнивших трупов.
Кроме сибиреязвенных преципитирующих сывороток, готовят и применяют преципитирующие диагностические сыворотки, используемые для диагностики бруцеллеза, других бактериальных и ряда вирусных заболеваний (ящура, бешенства, лейкоза, инфекционной анемии). И этих случаях реакции преципитации ставится не в пробирках, a агаропом геле в специально выштампованных в нем луночках.
Реакции преципитации используют в судебно-медицинской и ветеринарной экспертизе. Технологический принцип приготовления таких преципитирующих сывороток такой же как и преципитирующих сибиреязвенных сывороток. Но в качестве доноров чаще всего используют кроликов. [3, 8, 16]
2.3 Антитоксические сыворотки и технология их приготовления
Чаще всего антитоксические сыворотки готовят с целью диагностики клостридиозов: злокачественного отека, инфекционной энтеротоксемии, ботулизма и других заболеваний, возбудители которых образуют сильные экзотоксины и имеют множество серологических типов. В качестве антигенов при получении таких сывороток используют анатоксины.
Технологическим примером получения таких сывороток является изготовление антитоксических сывороток Cl. perfringens типов А, В, С, D, Е и F.
В качестве продуцентов таких диагностических сывороток чаще используют валухов тонкорунных пород в возрасте двух лет. Антигенами являются очищенные и концентрированные анатоксины, полученные с помощью соответствующих типов Cl. perfringens. Для каждого типа указанного микроба используют отдельных продуцентов, которых содержат в отдельных боксах. Антигены овцам вводят подкожно в возрастающих дозах с принятым интервалом 4--6 суток между инъекциями. Гипериммунизацию животных прекращают после получения сывороток с активностью, предусмотренной инструкцией по ее изготовлению. Поэтому в процессе эксплуатации у продуцентов берут кровь и в ее сыворотке определяют титры антитоксинов. Активность каждого типа антитоксических сывороток, устанавливают в реакции нейтрализации специфических токсинов при введении их смесей белым мышам или крысам и выражают ее количеством антитоксических единиц.
Получение антитоксических сывороток для диагностики других инфекционных заболеваний осуществляют по такой же схеме. Но в качестве продуцентов могут использоваться другие животные. Разумеется, что в схеме гипериммунизации животных в каждом случае имеются свои особенности. [16, 22]
2.4 Диагностические сыворотки для постановки реакции связывания комплемента и технология их приготовления
При ряде инфекционных заболеваний образуются так называемые комплементсвязывающие антитела. При их определении в практике используются специфические диагностические сыворотки, содержащие такие антитела. Показательным примером является приготовление специфических диагностических ящурных сывороток. Дело в том, что вирус ящура обладает высоким плюрализмом. Ом вызывается одним из вариантов вируса ящура. Идентификацию штамма циркулирующего вируса ящура проводят с помощью реакции связывания комплемента (РСК). Специфическую типовую и вариантную сыворотки получают от морских свинок, которых заражают вирусосодержащей суспензией соответствующего типа, с добавлением к ней сапонина и спустя 30--40 суток дополнительно гипериммунизируют тем же материалом путем двух-четырех внутримышечных инъекций. Через 7--10 суток после последней инъекции морских свинок обескровливают и из крови готовят инактивированную сыворотку. Сыворотку проверяют в РСК на активность и специфичность. В качестве антигена для изготовления сывороток используют штаммы вируса ящура, адаптированные к организму новорожденных крольчат или к культурам клеток.
Диагностические комплементсвязывающие сыворотки используются как контрольные при постановке РСК на бруцеллез, сап, кампилобактериоз, вирусные респираторные болезни, грипп и другие бактерийные, вирусные и паразитарные инфекции. Технологический принцип их изготовления тот же.
Следует иметь в виду, что при постановке РСК пробирочным способом для учета ее обычно используют гемолитическую (индикаторную) систему, в которой в качестве специфической используется гемолитическая сыворотка (гемолизин). Получается она на биопредприятии путем гипериммунизации кроликов эритроцитами баранов (валухов). Достижение титров гемолизина 1:6000 и выше дает основания к прекращению гипериммунизации кроликов. Через 7--10 суток после последней инъекции кроликам эритроцитов барана их обескровливают, получают сыворотку и консервируют ее фенолом.
При постановке РСК непременным условием является применение в качестве одного из ее компонентов комплемента. Комплемент-- это неспецифический фактор гуморального иммунитета, содержащийся в сыворотках крови теплокровных и холоднокровных животных. Наиболее изучен комплемент морской свинки. Поэтому при постановке РСК в качестве комплемента используют сыворотку крови морских свинок. Для его получения морских свинок выращивают в специальных питомниках. При этом нормы кормления, содержания животных должны соответствовать зооветеринарным требованиям. От здоровых животных, достигших массы 300--350 г, тотально из сердца берут кровь, собирают ее в емкости и отстаивают сыворотку, которую консервируют фенолом, в необходимых случаях высушивают лиофильным способом и после биологического контроля рассылают в диагностические лаборатории.
Следует заметить, что комплемент действует подобно ферменту на комплекс антиген -- антитело, то есть на антигены, уже связанные специфическими антителами. Основная функция комплемента литическая (растворяющая, разрушающая антиген). Нелитические свойства у комплемента проявляются при воздействии его на систему антиген -- антитело, где антиген является растворимым белком или вирусом. В данном случае имеет место лишь укрупнение иммунного комплекса. Это происходит в реакции конглютинации (РК), в которой используют нелитические или слаболитические комплементы лошади, свиньи; но не морской свинки. [6, 7, 9, 16]
2.5 Флуоресцирующие диагностические сыворотки
Метод обнаружения антигена при помощи люминесцирующих антител был впервые предложен А. Кунсом в 1942 году. Это позволило увидеть под люминесцентным микроскопом реакцию антиген--антитело. Сущность метода заключается в том, что по известному антителу, меченному флуорхромом, определяют неизвестный антиген. Некоторые флуоресцирующие красители (флуоресцеинизоцианата, флуоресцеинизотиоцианата, диметиламинонафталинсульфанилхлорид и другие), не нарушая специфичности антител, обладают способностью вступать в химическую связь с ними. Такое меченое антитело соединяется со специфическим антителом, образуя при этом конгломераты, светящиеся ярко-зеленым или зелено-желтым светом при люминесцентной микроскопии. Реакции такого типа называются реакциями иммунофлуоресценции (РИФ). В настоящее время известны методы прямых и непрямых РИФ.
Метод прямой РИФ был разработан Кунсом и Капланом. Гомологичное антитело, конъюгированное флуоресцентным красителем, соединяется с антигеном. В результате образуется флуоресцирующий комплекс антиген--антитело.
Методы непрямой РИФ включают три варианта:
1) Метод косвенного флуорохромирования антител. Предложен Веллером и Кунсом. Он основан на конъюгировании флуоресцентным красителем анти-антител и называется еще антигамма-глобулиновым методом. Конъюгированные флуорохромом анти-антитела (антигамма-глобулины) наносятся на заранее приготовленный комплекс антиген-- антитело. Результатом является образование флуоресцирующего комплекса антиген -- антитело -- анти-антитело.
2) Метод прямого флуорохромирования комплемента. Предложен Голдвассером и Шепардом, а затем Клейном и Буркхолдером. Антиген связывается с гомологичным антителом. На комплекс антиген-- антитело наносят конъюгированный флуорохромом комплемент. Последний, обладая способностью адсорбироваться на комплексе антиген -- антитело, связывается с таким комплексом. Под люминесцентным микроскопом обнаруживают флуоресцирующий комплекс антиген -- антитело -- комплемент. Этот метод чрезвычайно чувствительный и имеет преимущество перед методом связывания комплемента в гемолитической системе.
3) Метод косвенного флуорохромирования комплемента, или антикомплементарный метод, предложен Мюллером. На комплекс антиген -- антитело -- комплемент накосят конъюгированный флуорохромом антикомплемент. Последний готовят путем гипериммунизации кроликов сывороткой крови морской свинки (комплементом). Под люминесцентным микроскопом обнаруживают флуоресцирующий комплекс антиген -- антитело -- комплемент антикомплемент. Данный метод также является высокочувствительным. Несмотря на высокую чувствительность непрямых методов РИФ, в практике наиболее часто используется прямой и антигамма-глобу- линовый методы РИФ. Эти методы используются для быстрой и точной диагностики бешенства, орнитоза, полиомиелита, сибирской язвы, сальмонеллезов, кампилобактериоза и ряда других инфекций. Технологическим примером приготовления флуоресцирующих сывороток являются флуоресцирующие сальмонеллезные О-сыворотки (рис. 1).
Такие сыворотки предназначены для ускоренного обнаружения сальмонелл в патологическом материале, продуктах убоя животных, кормах, объектах внешней среды. Для их производства в качестве доноров используют кроликов. Их иммунизируют многократко формалинизированными антигенами из сальмонелл. От кроликов получают сыворотку крови с титром агглютининов не ниже 1: 6400--1: 12 800. Сыворотки адсорбируют концентрированой массой сальмонелл для удаления всех гетерологичных агглютининов. Образовавшийся агглютинат удаляют из сыворотки центрифугированием. Из адсорбированной сыворотки осаждают глобулины сульфатом аммония. Для очистки глобулинов от сульфата аммония проводят диализ против физиологического раствора. Очищенный глобулин метят флуоресцекнизотиоцианатом. Избыток флуорохрома удаляют путем пропускания меченых глобулинов через колонку сефадексом. Меченые глобулины консервируют мертиолятом, разливают в ампулы, лиофилизируют и сдают на контроль. При этом такие флуоресцирующие О-сыворотки (глобулины) проверяют на активность (красящий титр) на суточных агаровых культурах сальмонелл и на специфичность на суточных культурах сальмонелл и эшерихий.
Кроме указанных диагностических сывороток, в биопромышленности также готовятся гипериммунные сыворотки с целью использования их в реакциях нейтрализации (РН), задержки гемагглготинации (РЗГА), задержки гемадсорбции (РЗГАд), иммуноферментного анализа (ИФА) и других. Все они получаются путем гипериммунизации кроликов соответствующими антигенами. [1, 9, 16, 20]
Рисунок 1- Схема приготовления флуоресцирующих сывороток. [16]
2.6 Контроль диагностических сывороток
Контроль за качеством сывороток осуществляют на всех стадиях их изготовления. После производственного контроля каждая серия сывороток поступает в отдел биологического и технологического контроля (ОБТК), где проверяют ее физические свойства, стерильность, безвредность, специфическую активность после 20-суточной выдержки при 37° С. Кроме того, определяют содержание в сыворотке белка, водородных ионов (рН), электрофоретическую чистоту, апирогенность, остаточное содержание солей и другие показатели.
Физические свойства сывороток обычно определяют визуально. Нативная сыворотка должна быть прозрачной или иметь легкую опалесценцию. Допускается образование небольшого осадка, легкоразбивающегося в равномерную взвесь. Она должна быть без признаков повышенной вязкости. Сухая, сыворотка, должна иметь определенный процент влажности (не более 6%) и легко растворяться в течение 1--2 минут.
Контроль на стерильность сыворотки осуществляется путем высева ее на среды для исключения контаминации бактериями (МПА, МПБ с глюкозой, МППБ под маслом) и грибками (агар Сабуро, среда Чапека).
Безвредность сывороточных препаратов проверяют на морских свинках массой по 300--400 г, когда им подкожно вводят 10 мл сыворотки по 5 мл с обеих сторон. Иногда для этих целей используют кроликов. Животные, получившие сыворотку, должны оставаться здоровыми, не иметь заметных местных или общих реакций б течение 10-суточного наблюдения. Если такие изменения имеются, то контроль повторяют на удвоенном количестве животных. При повторном неудовлетворительном результате контроля на безвредность вся серия препарата бракуется.
Активность некоторых других сывороток определяют в реакции агглютинации или нейтрализации. Например, активность противолептоспирозной сыворотки определяют в реакции микроагглютинации (РМА) путем разведения сыворотки от 1: 1000 до 1:100 000. В качестве антигенов используют живые культуры лептоспир всех серологических групп, которыми иммунизировали животных. Сыворотка считается активной при положительной РМА в два креста в разведении 1: 25 000 и выше с лептоспирами каждой группы (Малахов Ю. А., Шуплико А. Н., Соловьева В. С, 1981).
Определение активности антитоксических сывороток против анаэробных инфекций проводится в реакции нейтрализации специфических токсинов на белых мышах массой 16--18 граммов. Активность сыворотки обычно выражают антитоксическими единицами (АЕ). Расчет количества АЕ в 1 мл сыворотки проводят по формуле 1:
А=(Д*Р)/100 (1)
где: А -- искомое количество антитоксических единиц; Д --количество минимальных смертельных доз (ДЛМ) в 1 мл типового токсина; Р -- последнее разведение сыворотки, предохранившее от гибели не менее 50% белых мышей.
Активность антитоксических сывороток Сl. perfringens различных типов применяемых для диагностики болезней животных, вызываемых микробами Cl. perfringens, должна быть не ниже следующих показателей: тип: А -- 20 АЕ, тип С -- 40 АЕ, тип D --100 АЕ и тип Е -- 20 АЕ.
Специфичность сывороток каждого типа проверяют в реакции нейтрализации на белых мышах с токсинами А, С, D и Е. Типовые сыворотки нейтрализуют токсины соответствующих типов. При положительной реакции нейтрализации белые мыши не погибают (Кириллов Л. В., Каган Ф. И., 1981).
Активность диагностических агглютинирующих сывороток (например, сальмонеллезные монорецепторные О- и Н-агглютннирующие сыворотки, агглютинирующие О-коли сыворотки) определяют в пробирочных РА и на стекле с соответствующими стандартными антигенами из убитых микроорганизмов. Специфичность диагностических сывороток определяют в РА с гетерологичными культурами микроорганизмов, не имеющих антигенных родственных связей, и культурами одной-двух серогрупп микроорганизмов, родственных по антигенному составу.
Активность и специфичность флуоресцирующих сальмонеллезных, противорожистых, сибиреязвенных и других сывороток определяется с применением люминесцентного микроскопа. Из суточных агаровых культур соответствующих гомологичных и гетерологичных микроорганизмов готовят мазки и обрабатывают их испытуемой флуоресцирующей сывороткой. Препарат просматривают под люминесцентным микроскопом. При этом наблюдают, свечение гомологичных микробов, а свечение гетерологичных микробов отсутствует. Чистоту белковых фракций сывороточных препаратов обычно определяют электрофоретическими методами.
Апирогенность лечебно-профилактических сывороток проверяют на трех кроликах массой 1,5--2 кг. Кроликов до опыта в течение трех суток ежедневно взвешивают и определяют у них температуру тела, которая должна быть в пределах 38,6;--39,8° С. Кроликов, у которых имеется склонность к снижению массы и повышению температуры, в опыт не берут. Накануне опыта, вечером, у кроликов, забирают остатки корма и во время опыта их не кормят. Испытуемую сыворотку подогревают до 37° С и вводят внутривенно в краевую ушную вену в дозе 1 мл/'кг массы: Через, один, два и три часа после введения сыворотки у кроликов измеряют температуру тела. Она не должна повышаться более чем на 0,8° С. После, осуществления контроля сывороток на каждую серию составляют паспорт, в котором отмечают основные технологические, лечебно-профилактические и специфические показатели, а для диагностических вывороток еще и титр антител в РСК, РН, РИД, РТГА, РИФ, ИФА и других реакциях. В паспортах (инструкциях) обязательно указывают сроки и условия хранения. [16]
3. Антигены-диагностикумы. Контроль диагностических стандартных антигенов
Исследования сывороток больных животных на наличие в них антител, а также определение титров антител в специфических сыворотках при их промышленном изготовлении осуществляются с помощью антигенов-диагностикумов. По происхождению такие антигены подразделяются на бактериальные, риккетсиальные, вирусные.
При изготовлении бактериальных антигенов используют или живые культуры или гомогенные стандартизированные взвеси убитых микробов. Антигены из живых культур, применяются редко, так как это связано с определенными технологическими трудностями, а также возможностью заражения лабораторного персонала. Диагностикумы из убитых культур являются предпочтительными. Приготовление диагностикумов связано, прежде всего, с тщательной подготовкой и селекцией штаммов микроорганизмов из которых они готовятся. Производственные штаммы должны находиться в S-форме. Это обеспечивает им хорошую агглютинабильность; специфичность и образование устойчивой гомогенной взвеси. Чаще всего для получения диагностикумов определенные штаммы микроорганизмов выращивают на агаровых средах. Культуры микробов смывают с поверхности агара, а затем их инактивируют 0,5%-м раствором формалина (бруцеллезный, туляремийный антиген), 1%-ми растворами борной кислоты (листериозный, сальмонеллезные, коли-антигены), нагреванием (бруцеллезный антиген) и другими методами.
Исходя из наших знаний об объективно существующем разнообразии антигенной структуры возбудителей инфекционных заболеваний, в производстве биологических препаратов получают различные диагностикумы. Например, из цельных микробных клеток готовят диагностикумы из бактерий, имеющих известную антигенную обособленность. В других случаях диагностикумы содержат антигены с преобладанием отдельных структурных элементов. Например, из бактерий кишечной группы методом селекции штаммов и обработки их соответствующими агентами получены О-, Н- и Vi-диагностикумы (Зуев А. С., Новоселова А. И., Ликина И В. 1956; Зуез А. С, 1959, 1963, и др.).
О-диагностикумы готовят обычно из неподвижных вариантов культур, полученных при выращивании на плотных питательных средах и обработанных спиртом или глицерином. Сальмонеллезные Н-монодиагностикумы (а, Ь, с, с и другие) готовят из бульонных или агаровых культур путем добавления к ним формалина, но не более 0,1--0,3%-й его концентрации. Наиболее трудно приготовить Vi-антиген, так как он обладает малой устойчивостью к различным воздействиям, в том числе и к формалину. Готовится он из поверхностных компонентов микробных клеток, консервируется формалином, но перед формалинизацией его стабилизируют 25%-м раствором хлорида кальция.
Антигены бывают корпускулярными и растворимыми.
Корпускулярные антигены представляют собой взвесь убитых, реже живых микробов в физиологическом растворе с определенной концентрацией консерванта. Во всех случаях антигены подвергают высокой степени очистки. Такие антигены используются для постановки РА, РСК, РДСК.
Примером получения корпускулярного антигена является изготовление листериозного антигена УНИИЭВ для РСК из производственных штаммов листерий двух серогрупп (по 2 штамма на серогруппу). Штаммы листерий выращивают на мартеновском агаре при температуре 37° С раздельно в течение 24--48 часов до получения обильного роста. Культуры выросших микробов смывают стерильным физраствором, смешивают и центрифугируют в течение 20 минут при 2000 об/мин. Осадок листерий подвергают экстрагированию вначале спиртом, а затем смесью спирта и серного эфира. После этого опять производят осаждение биомассы листерий центрифугированием при 2000 об/мин в течение 20 минут. Такую обработку антигена повторяют несколько раз. В конечном итоге листерий консервируют 1%-м раствором борной кислоты, доведя концентрацию микробной взвеси до 50 млрд/мл. Готовый антиген разливают в ампулы и подвергают контролю.
Подобные антигены, с рядом особенностей в технологии их изготовления, применяют в РА для диагностики бруцеллеза, кампилобактеркоза, микоплазмоза, сальмонеллезов и других инфекций.
Корпускулярные риккетсиозные, вирусные антигены-диагностикумы готовят из тканей зараженных животных, желтков зараженных эмбрионов или из культур клеток. Такие материалы предварительно подвергают обработке эфиром и дифференциальному центрифугированию для максимального освобождения от тканевых элементов. Очищенную взвесь риккетсий или вирусов консервируют 0,25--0,5%-м раствором фенола или 0,2%-м раствором формалина.
Растворимые антигены чаще всего готовят в виде экстрактов из агаровых культур соответствующих микробов. Они используются для постановки серологического диагноза с применением РСК при сапе, бруцеллезе, инфекционном эпидидимите баранов и других заболеваниях, а также при постановке диагноза с применением реакций иммунодиффузии (РИД) на бруцеллез, лейкоз и многие другие инфекции.
Следует иметь в виду, что ранее бытующее мнение о необходимости применения при постановке РСК только растворимых антигенов оказалось неверным. В настоящее время доказано, что для РСК можно использовать и корпускулярные антигены. Причем, при серологической диагностике бруцеллеза используется единый корпускулярный антиген из слабовирулентного штамма Bruceiia abortus 19, инактивированного нагреванием. Такой антиген применяется при серологической диагностике бруцеллеза с применением РА, РСК и РДСК. Как было показано выше, корпускулярный антиген применяется для РСК и при диагностике листериоза.
Чтобы повысить эффективность диагностики в системе организации противоэпизоотических мероприятий, необходимо расширить ассортимент высокоэффективных диагностикумов, пригодных к использованию в лабораторных и полевых условиях. Для этого готовят корпускулярные антигены, окрашенные какими-либо красителями. Например, для постановки пластинчатой реакции агглютинации на бруцеллез в настоящее время широко применяется антиген, представляющий взвесь в буферном растворе микробных клеток Вг. abortus 19, инактивирозанных нагреванием и фенолом и окрашенных бенгальской розовой в малиново-розовый.
Длительное благополучие нашей страны по сапу требует усиленного контроля за состоянием конепоголовья по этой болезни в связи с восприимчивостью к нему неиммунных животных. Для этого необходимы экспресс-методы диагностики сапа, позволяющие в течение нескольких минут установить эпизоотический статус лошадей по этому заболеванию.
В 1988 году сотрудниками ВГНКИ, специалистами Курской биофабрики и «Скотоимпорта» разработан антиген для пластинчатой реакции агглютинации, представляющий взвесь в буферном растворе инактивированной автоклавированной культуры возбудителя сапа, выращенной в синтетической питательной среде и окрашенной бенгальским розовым (Букова Н. К., Шаров А. Н., Климова А. И. и др., 1988; Шаров А. К, Букова Н. К., Климова А. И., Коровенко А. И., 1992).
При постановке диагноза на бруцеллез для кольцевой реакции с молоком используется антиген в виде взвеси инактивированных нагреванием бруцелл, окрашенных гематоксилином в синий цвет. При диагностике пуллороза -- тифа птиц при постановке кровекапельной реакции агглютинации (ККРА) на стекле используют цветной антиген, представляющий собой гомогенную взвесь микробных клеток S. galiinarum, убитых формалином и окрашенных кристаллвиолетом. Антиген готовится из пяти штаммов указанного микроба, вирулентных для птиц и находящихся в S-форме. Из Mycoplasma gallisepticurn готовится антиген для диагностики респираторного, микоплазмоза птиц. Он представляет собой взвесь микробных клеток, обезвреженных фенолом и окрашенных 0,5%-м спиртовым раствором генцианвиолета. При некоторых инфекционных рекомендуются и производятся промышленным способом эритроцитарные диагностикумы.
Такие антигены представляют собой 5--10%-ю взвесь эритроцитов барана, сенсибилизированных полисахаридно-полипептидной фракцией соответствующих возбудителей болезни. Они предназначены для прижизненной диагностики указанных и некоторых вирусных инфекций с применением реакции непрямой гемагглютинации (РИГА).
Технологический процесс получения эритроцитарных диагностикумов на примере пуллорного антигена представлен на рисунке 2.
Для получения полисахаридно-полипептидной фракции проводят, гидролиз бактерийной массы сальмонелл уксусной кислотой и осаждение ее этиловым спиртом. Кровь для получения эритроцитов берут стерильно из яремной вены животного в сосуд со стерильным раствором Олсевере. Эритроциты несколько раз отмывают стерильным фосфатным буфером, центрифугируют, консервируют формалином и ресуспендируют в фосфатно-буферном растворе. Затем их сенсибилизируют полисахаридно-полипептидной фракцией сальмонелл. Сенсибилизированные эритроциты разводят фосфатным буфером с формальдегидом до 10%-й концентрации, расфасовывают во флаконы и сдают на контроль. Эритроцитарный антиген контролируют на активность, специфичность, стерильность, концентрацию эритроцитов и рН.
При получении антигенов-диагностикумов, кроме выращивания соответствующих микроорганизмов поверхностным способом на агаровых питательных средах, предлагаются технологии производства антигенов из производственных штаммов, культивируемых глубинным способом в четвертях и реакторах. Так, Н. В. Мельник, Н. Д. Скичко, Н. И. Зенов и др. (1996) на Щелковском биокомбинате апробировали технологию производства единого бруцеллезного антигена для серологической диагностики бруцеллеза сельскохозяйственных животных в РА, РСК и РДСК путем культивирования слабовирулентного штамма Br. abortus 19 в питательных средах в биореакторах. Сравнительное изучение антигенов, приготовленных из культур бруцелл, выращенных на плотных и жидких питательных средах, не выявило существенных различий их активности. Кроме того, он оказался специфичным, не обладал гемотоксичностью и антикомплементарностью.
В условиях Ставропольской биофабрики отработана и усовершенствована технология изготовления листериозного антигена УНИИЭВ для РСК. При этом были использованы питательные среды на основе гидролизатов из непищевого белоксодержащего сырья как отходов вакцинно-сывороточного и инкубаторного производства. Вторую матровую расплодку листерий из производственных штаммов «Бурынь», «Тернополь», К-17, № 1 получали в баллонах емкостью 16--20 литров. Каждый штамм выращивали раздельно. Для получения большого количества бакмассы производственное культивирование осуществляли в реакторах емкостью 300--600 литров глубинным способом.
После концентрирования листерий методом центрифугирования или на установке полых волокон (УПВ-6) бакмассу всех штаммов соединяли в равных соотношениях, и смесь обрабатывали этиловым спиртом и серным эфиром согласно инструкции по изготовлению листериозного антигена. Концентрацию антигена доводили до 50 млрд/см3. Принципиальная схема приготовления эритроцитарного диагностикума из S. Galiinarum показана на рисунке 2.
Рисунок 2-Схема приготовления эритроцитарного диагностикума из S. galiinarum
При проверке его активности и специфичности отличий от антигена, полученного из листерий, выращенных на плотных средах не установлено. Применение данной технологии получения листериозного антигена УНИИЭВ для РСК позволяет получить за короткое время большое количество бактериальной массы значительно уменьшает затраты труда, материалов и знергоресурсов.
Диагностические антигены (противосибиреязвенные, бруцеллезные, пуллорозные, микоплазмозные, лейкозные и другие) контролируют на стерильность, активность и специфичность. Стерильность антигенов, как и других биопрепаратов, определяют высевами их на питательные среды с целью исключения контаминации бактерийной и грибковой микрофлорой -- МПА, МПБ с глюкозой, МППБ с вазелиновым маслом, агар Сабуро или Чапека.
Активность и специфичность антигенов испытывают в соответствующих серологических реакциях (РА, РСК, РП и других) со специфическими стандартными сыворотками, содержащими строго определенное количество международных единиц (ME) антител. Одновременно их испытывают с негативными сыворотками и физиологическим раствором, с которыми реакции должны быть отрицательными. По стандартным положительным сывороткам определяют рабочую концентрацию соответствующего антигена. Затем его расфасовывают по ампулам или флаконам и после соответствующего контроля отправляют в диагностические лаборатории. [16, 18, 20, 21]
4. Особенности приготовления вирусных диагностикумов
Приготовление вирусных диагностикумов (антигенов и сывороток) имеет свои особенности. Диагностические антигены готовят, используя органы зараженных животных, то есть в таком случае речь идет об органных антигенах. Если такие антигены готовят с использованием культур клеток, то получают, культуральные антигены. Основным их недостатком является, содержание в своем составе балластных белков, в том числе белков других вирусов, которые могут быть в исходном сырье. Это влияет на специфичность, активность антигенов. Считают, что в таком случае весьма перспективны, работы по конструированию синтетических антигенов. Их преимущество, в том, что они обладают высокой специфичностью, легкой стандартизацией, стабильностью и безвредностью.
При производстве диагностических сывороток, придерживаясь общих принципов их получения, необходимо учитывать:
1) антиген для иммунизации должен быть предельно чистым;
2) схема иммунизации должна быть как можно проще и легко воспроизводима;
3) при выборе доноров необходимо использовать те виды животных, на клетках которых готовился антиген.
Задача получения специфических антител в настоящее время решается с помощью гибридомной технологии получения моноклональных антител. [14, 15]
5. Общая характеристика бактериофагов
Бактериофаги представляют собой вирусы, поражающие бактерии и вызывающие их разрушение -- лизис. Открытие явления лизиса у возбудителя сибирской язвы впервые зафиксировал отечественный ученый Н. Ф. Гамалея еще в 1898 году. Однако причины такого лизиса оставались невыясненными. В 1915 году Творт выделил особый фильтрующийся агент, который вызывал лизис колоний стафилококка. В 1917 году д,Эррель такой агент выделил из испражнений больного тяжелой формой бактериальной дизентерией. Этот агент вызывал растворение культур возбудителя дизентерии. Фильтрация растворенной культуры и новые добавления фильтратов к свежим культурам приводили к их лизису. Такой переносимый из культуры в культуру литический агент д,Эррелем был назван бактериофагом. В последующем, в сороковые годы, с помощью электронного микроскопа удалось подтвердить, что бактериофаг является вирусом. В настоящее время фаги выявлены почти у всех патогенных и многих непатогенных прокариотных микроорганизмов, у энтеробактерий, микобактерий, коринебактерий, стрептококков, стафилококков, сардин, споровых и актиномицетов. Бактериофаги широко распространены в природе. Практически они обнаруживаются во всех объектах среды, где обитают микроорганизмы.
Бактериофаги, выделенные из патогенных микроорганизмов, мо гут быть использованы как специфические лечебно-профилактические биопрепараты.
Давно установлено, что в популяции одного микроорганизма могут появиться клетки, устойчивые к фагам, и из них вырастают вторичные фагоустойчивые микроорганизмы. Изучая свойства вторичных фагорезистентных культур Salmonella ovis, И. К. Тутов (1961) установил, что они не изменяют антигенных свойств, но теряют свою вирулентность. На основании этих исследований была доказана возможность использования вторичных фагорезистентных культур с целью изготовления живых вакцин.
Используя визуальный феномен лизиса культур микроорганизмов, специфическим бактериофагом, в необходимых случаях его используют как диагностический тест. Например, в бактериологических лабораториях феномен бактериофагии используется как высокоспецифическая реакция при диагностике сибирской язвы.
Для этой цели биопредприятиями выпускается два сибиреязвенных бактериофага: КВИЭВ и Гамма МВА. Для их изготовления используют авирулентные штаммы возбудителя сибирской язвы. Такие культуры выращивают в МПБ или дрожжевом, бульоне. Непременным условием является то, что при засеве нужно использовать молодые, 5--6 часовые расплодки производственных штаммов возбудителя. Кроме того, сразу после посева штаммов В. antrhacis в бутыли вносится бактериофаг. Содержимое бутылей перемешивается. И они ставятся в термостат на 10--18'часов. По истечении указанного срока среду фильтруют через стерилизующие пластины или патроны. В фильтрате остается только бактериофаг. После изготовления бактериофага его разливают в ампулы и подвергают контролю на стерильность, активность и специфичность.
Сибиреязвенный бактериофаг используется как диагностикум при дифференциации - возбудителя сибирской язвы от антракоидов.
Примерно по такой же методике готовятся бактериофаги и к другим микроорганизмам. Но выращивание их, например сальмофагов, колифагов, проводится в точение 6--10 часов при 37° С и выдерживании до 24 часов при комнатной температуре (Николаенко Н. И., 1954; Шустер Б. Ю., Малахов Ю. А., Соловьева В. С, Тугаринов О. А., 1981). [8, 11]
6. Аллергены, технология их приготовления. Контроль аллергенов
Аллергическая диагностика ряда инфекционных (чаще хронических) заболеваний животных и людей основана на феномене сохранения повышенной чувствительности организма к повторному введению того же антигена. В основе такой повышенной чувствительности лежат реакции-гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), которые проявляются спустя несколько часов, иногда суток после введения аллергена чувствительному (больному) организму. Обычно ГЗТ представляют собой клеточный феномен, в котором клетками-эффекторами, вступающими во взаимодействие с антигеном (аллергеном), являются сенсибилизированные Т-лимфоциты лимфатических тканей и органов (лимфатических узлов, селезенки, грудного протока, перитокиальной жидкости, периферической крови и т. д.). Такие реакции выявляются постановкой кожных, проб соответствующим аллергеном они связаны с клеточными механизмами. Для возникновения ГЗТ, как показывает широкий опыт аллергической диагностики многих, хронических инфекционных болезней, необходим длительный контакт организма с антигенами инфекционного агента. Состояние ГЗТ обычно развивается через 2--3 недели после заражения организма и может, сохраняться годами. Уровень аллергии непостоянен, может меняться в широких пределах и даже временно исчезать под действием различных факторов, например, при истощении. Животные в состоянии аллергии отвечают на введение аллергенов общей и местной реакцией. Особенно демонстративно протекает реакция при введении аллергенов внутрикожно и нанесение их на конъюнктиву. В толще кожи образуется инфильтрат, внешне проявляющийся припухлостью различной консистенции и болезненности. Инфильтраты возникают через несколько часов после введения аллергенов и достигают наибольшего развития через двое-трое суток. При нанесении аллергенов (туберкулина, маллеина) на конъюнктиву развивается гнойный конъюнктивит. Наибольшая интенсивность реакции наблюдается через 6--9--12 часов после нанесения аллергенов на конъюнктиву.
При подкожном и внутривенном введении аллергенов зараженные животные реагируют повышением температуры тела, учащением дыхания, пульса.
Простота метода, достоверность полученных результатов, возможность применения непосредственно в хозяйствах обусловили широкое применение аллергенов в качестве биопрепаратов с целью прижизненной диагностики бруцеллеза, туберкулеза, сапа. Для диагностики этих заболеваний широко используют бруцеллин, туберкулин, маллеин.
Аллергены, являясь диагностическими препаратами, также подвергаются исследованиям с целью определения их качественных и количественных показателей. Наиболее часто в качестве аллергенов используют для аллергической диагностики бруцеллеза -- бруцеллин, туберкулеза -- туберкулин, сапа -- маллеин. Каждую приготовленную серию аллергенов проверяют на отсутствие механических примесей, внешний вид препарата, правильность упаковки, стерильность, безвредность, специфичность и активность.
Стерильность указанных аллергенов проверяют высевами из трех ампул или флаконов на питательные среды, элективные для аэробов, анаэробов и грибов. Посевы должны оставаться стерильными в течение десяти суток.
Безвредность бруцеллина, туберкулина, маллеина проверяют на белых мышах массой 18--25 г, путем подкожного введения им препарата в области спины, иногда паха. Аллергены считаются безвредными, если все животные остаются клинически здоровыми и в течение десяти суток наблюдения у них на месте инъекции нет воспалительных реакций.
Технология определения специфичности и активности указанных аллергенов имеет свои особенности.
Специфичность каждой серии бруцеллина проверяют на здоровых морских свинках белой масти массой 350--400 г. Препарат вводят вкутрикожно в дозе 0,1 мл в выбритый участок боковой поверхности туловища. Одновременно вводят таким же способом референс-препарат в дозе 200 единиц активности (ЕА). Бруцеллин считают специфичным, если он не вызывает аллергической реакции у здоровых животных через 24 и 48 часов после введения.
Кроме того, на специфичность и отсутствие агглютинирующих свойств каждую десятую серию бруцеллина проверяют на здоровых, не привитых против бруцеллеза овцах. Им вводят аллерген под кожу нижнего века в дозе 0,5 мл и внутрикожно в подхвостовую складку в дозе 0,2 мл. Одновременно в другую подхвостовую складку вводят стандартный бруцеллин в дозе 400 ЕА. Реакцию учитывают через 48 часов. Препарат считается специфичным, если он не вызывает аллергических реакций на месте его введения. Через 10-- 15 суток после введения бруцеллина у овец берут кровь и с ее сывороткой ставят РА и РСК с бруцеллезным антигеном. Они должны быть отрицательными.
Активность бруцеллина определяют на 10--15 сенсибилизированных бруцеллами различных видов морских свинках весом 350-- 400 г. Через четыре недели после прививки морским свинкам вводят внутрикожно испытуемый бруцеллин и референс-препарат а дозе 200 ЕА в объеме 0,1 мл. Если бруцеллин активен, то через 24 часа после введения бруцеллинов на месте их введения появляется аллергическая реакция в виде отечного воспаления и гиперемии кожи (Шумилов К. В., Климанов А. И., Малахова Т. И., 1981). Активность туберкулинов на содержание международных единиц (ME) определяют в сравнении испытуемой серии с референс-препаратами на сенсибилизированных морских свинках. [9, 14]
7. Моноклональные антитела
Антитела строго специфичны и способны выявить минимальные различия в химическом составе и пространственной конфигурации молекул. В результате сложной антигенной структуры многих микроорганизмов при иммунном ответе на них в организме образуются высокогетерогенные (неоднородные) антитела, то есть в сыворотке будет содержаться смесь антител. Последние продуцируются разными линиями В-лимфоцитов и направлены к различным детерминантам антигена. Если бы определенную линию лимфоцитов удалось выделить и культивировать вне организма, как культуры клеток, то полученный клон лимфоцитов продуцировал бы однородный тип антител -- моноклональные антитела. В иммунологии такая идея возникла давно. Но, к сожалению, антителобразующие лимфоциты плохо растут в культуре и зачастую отмирают. В то же время клетки злокачественной опухоли костного мозга, миеломы, обладая способностью к неограниченному росту, интенсивно продуцируют иммуноглобулины, идентичные между собой по структуре. То есть по сути это моноклональные антитела к неизвестному нам антигену.
Ученые давно стремились на основании гибридомной технологии получить такие клоны гибридных клеток, которые бы сочетали энергию размножения миолемных клеток с высокой продукцией антител лимфоцитов, то есть, чтобы они постоянно продуцировали моноклональные антитела.
Первые успехи в данном направлении были достигнуты английскими учеными: Келлером и Милстейном (1975). Они получили в результате слияния, клеток миеломы РЗ и лимфоцитов из селезенки мышей, иммунизированной эритроцитами в присутствии полиэтиленгликоля, гибридные клетки, которые при культивировании в селективной среде продуцировали, иммуноглобулины только к эритроцитам. Такие клетки-химеры или гибридомы будучи полученными путем слияния антителобразующих лимфоцитов и опухолевых клеток, наследовали способность к неограниченному росту в культуре клеток и в то же время к продукции антител определенной специфичности (моноклональных антител).
Но следует иметь в виду, что после слияния клеток двух личных линий образуется клон, антитела, которые он образует, необязательно сразу будут моноклональными в иммунологическом смысле, так как в каждой клетке гибридного клона вначале присутствуют хромосомы обеих родительских клеток. Экспрессия этих хромосом ведет к продукции как селезеночных, так и миеломных иммуноглобулинов. Однако на ранних стадиях размножения гибридных клеток они быстро утрачивают часть хромосом. Важным при этом является выделить клоны клеток, потерявших хромосомы, присущие миеломе, но сохранившие хромосомы иммунных лимфоцитов. То есть выделяют те клоны клеток, которые синтезируют только тяжелые и легкие цепи иммуноглобулинов к заданному антигену.
После открытия Келлера и Милстейна, признанного одним и важнейших за период с 1970 по 1980 годы, в мире стали, проводиться работы по получению моноклональных антител к различным по природе антигенам с помощью гибридомных клеток. Так, Л. П. Дьяконову с сотрудниками в течение 1982--1995 годов удалось получить новые мутантные клетки, осуществить их гибридизацию с лимфоцитами и другими не растущими в культуре ткани клетками (энтероцитами и др.). Получение культур клеток открывает широкую перспективу иммунологических исследований, по получению вида и типоспецифических моноклональных антител к различным возбудителям заболеваний. При мечении моноклокальных антител флуорохромами и ферментами появляется возможность широко использовать моноклональные антитела их при диагностике бактерийных, грибковых и вирусных заболеваний с применением РИФ и ИФА.
Например, сотрудниками Всероссийского НИИ бруцеллеза и туберкулеза животных совместно с МНИИ фтизиатрии и пульмонологии Минздравмедпрома России получены моноклональные антитела, специфично взаимодействующие с поверхностными антигенами микобактерий туберкулеза бычьего вида. Ими разработана иммуноферментная тест-система для проведения идентификации микобактерий туберкулеза бычьего вида и дифференциация их от микобактерий человеческого вида и атипичных, медленно растущих микобактерий. Полученные данные свидетельствуют о высокой специфичности моноклональных антител и корреляции результатов, полученных методами ИФА и общепринятыми бактериологическими методами исследований. В то же время иммуноферментный, метод является высоковоспроизводимым, требует для обнаружения антигена малое количество микробной массы и, самое главное, он непродолжителен, что позволяет оперативно принимать меры по оздоровлению выявленных неблагополучных по туберкулезу пунктов.
В диагностике вирусных болезней животных весьма перспективным является получение моноклональных антител на основе гибридомной технологии. Ценность этого метода заключается в том, что гибридомные линии клеток можно хранить в замороженном состоянии, поэтому для научных и практических целей создаются гибридомные банки.
Кроме диагностических целей, моноклональные антитела могут использоваться для определения доз лекарственных препаратов, для выявления в пищевых продуктах аллергенов, для выявления у больных злокачественных опухолей. С помощью моноклональных антител возможно также выделение из сложных смесей биологически активных веществ (белков, гормонов, токсинов). [16, 19]
8. Молекулярная диагностика
Успехи современной медицины и сельского хозяйства часто зависят от того, удается ли обнаруживать специфические вирусы, бактерии, грибы, паразитические микроорганизмы, белки и низкомолекулярные соединения в организме человека или животных, в растениях, воде или почве. Например, профилактику и лечение любого инфекционного заболевания значительно облегчает ранняя и точная идентификация вызвавшего его патогенного микроорганизма. Для проведения многих диагностических процедур необходимо сначала вырастить культуру потенциально патогенного микроорганизма и лишь затем проанализировать спектр его физиологических свойств. Хотя подобные тесты весьма эффективны и обладают достаточно высокой специфичностью, они часто занимают много времени и являются дорогостоящими. Это относится к идентификации и бактерий, и паразитических микроорганизмов. Кроме того, весьма ограничена возможность выявления тех патогенных микроорганизмов, которые плохо растут в культуре либо вообще не поддаются культивированию. В качестве примера можно привести облигатных внутриклеточных паразитов Chlamydia trachomatis, которые вызывают хламидиоз, болезнь, передающуюся половым путем и распространенную в Северной Америке и Европе. Хламидиоз трудно диагностировать, поскольку для этого необходима перевиваемая культура клеток. При этом часто получают ложноотрицательные результаты (т. е. ошибочно диагностируют отсутствие микроорганизма), в результате чего не проводится адекватное лечение. Безусловно, если для выявления микроорганизма необходимо выращивать его в культуре, то рутинной может стать идентификация, лишь нескольких из всех известных патогенных микроорганизмов. Чтобы устранить это принципиальное ограничение, были разработаны методы молекулярной диагностики, в основе которых лежат иммунологические подходы или методы обнаружения специфической ДНК.
Любой метод выявления патогенных микроорганизмов должен быть достаточно простым и обладать высокой специфичностью и чувствительностью. Специфичный диагностический тест должен давать положительный ответ только на микроорганизм или молекулу-мишень, чувствительный -- обнаруживать очень малые количества такой мишени даже на фоне других микроорганизмов или молекул, загрязняющих образец. Простота метода подразумевает, что он является достаточно продуктивным, эффективным и недорогим для рутинного применения.
По оценкам специалистов, объем мирового рынка иммунодиагностических тестов в 1993 г. составил 3,4 млрд. долл. США и в ближайшие 10--15 лет будет возрастать на 5--10% ежегодно. В 1994 г. объем мирового рынка ДНК-диагностических тестов был равен примерно 80 млн. долл., к 2000 г. он, по-видимому, составит 600 млн. долл., а к 2004 г. -- 2 млрд. долл. [1, 7]
8.1 Методы иммунодиагностики
Многие иммунологические системы детекции обладают высокой чувствительностью и специфичностью, являясь в то же время достаточно простыми. Они широко используются для тестирования лекарственных препаратов, оценки и мониторинга различных онкологических заболеваний, определения специфических метаболитов, идентификации и контроля патогенных микроорганизмов, но имеют и свои ограничения. Если молекулой-мишенью является белок, то необходимо обеспечить экспрессию детерминирующих его генов и создать условия, в которых не происходит маскирование или блокирование сайта связывания с антителом. Традиционные процедуры диагностики возбудителей инфекции опираются либо на набор характеристик патогенного микроорганизма, либо, что предпочтительнее, на одну уникальную, легко различимую его особенность. Клинические микробиологи пытаются найти тот минимальный набор биологических характеристик, при помощи которого можно будет гарантированно обнаруживать и идентифицировать патогенные микроорганизмы. Например, некоторые возбудители вырабатывают специфические биохимические соединения, которые и необходимо обнаружить в биологическом образце. Часто подобную маркерную молекулу можно выявить непосредственно, проведя высокоспецифичный биохимический анализ. Но такой подход неизбежно приведет к увеличению числа индивидуализированных систем детекции патогенных микроорганизмов. Более предпочтительным был бы универсальный метод, позволяющий выявлять любую маркерную молекулу независимо от ее химической природы. Именно таким является метод, основанный на идентификации комплексов антиген-антитело.
Ферментный иммуносорбентный анализ. Существует целый ряд подходов, позволяющих определить, произошло ли связывание антитела с антигеном-мишенью. Один из них -- это ферментный иммуносорбентный анализ (ELISA), который часто используют для диагностики. Процедура включает следующие этапы (рис. 3).
1) Образец, в котором хотят обнаружить специфическую молекулу или микроорганизм, фиксируют на твердой подложке, например на пластиковой микротитровальной плашке, обычно имеющей 96 лунок
2) К фиксированному образцу добавляют антитело, специфичное к маркерной молекуле (первое антитело), затем промывают лунку, чтобы удалить несвязавшиеся молекулы первого антитела
3) Добавляют второе антитело, которое специфически связывается с первым антителом и не взаимодействует с маркерной молекулой. К этому антителу присоединен фермент (например, щелочная фосфатаза, пероксидаза или уреаза), катализирующий превращение неокрашенного субстрата в окрашенный продукт. Промывают лунку, чтобы удалить несвязавшиеся молекулы конъюгата второе антитело-фермент.
Рисунок 3 - Обнаружение антигена-мишени с помощью ELISA. Е--фермент, присоединенный ко второму антителу.
Если первое антитело не связывается с мишенью образца, то оно удаляется при первом промывании. Поскольку при этом конъюгату второе антитело--фермент не с чем связываться, он удаляется при втором промывании, и образец остается неокрашенным. Если связывание с мишенью происходит, то второе антитело присоединяется к первому, и конъюгированный фермент катализирует образование легко регистрируемого окрашенного продукта.
Основной принцип ELISA -- специфическое связывание первого антитела с мишенью. Если молекула-мишень представляет собой белок, то его очищенный препарат обычно используют для получения антител, при помощи которых затем и выявляют данную мишень. Антитела, которые образуются в сыворотке (антисыворотке) крови иммунизированного животного (обычно кролика), связываются с разными антигенными детерминантами (эпитопами) молекулы-мишени. Такую смесь антител называют поликлональным препаратом. Использование поликлональных антител имеет два недостатка, существенных для некоторых методов диагностики: 1) содержание отдельных антител в поликлональном препарате может варьировать от одной партии к другой; 2) поликлональные антитела нельзя применять, если необходимо различить две сходные мишени, т. е. когда патогенная (мишень) и непатогенная (не-мишень) формы различаются единственной детерминантой. Однако эти проблемы вполне разрешимы, поскольку сейчас научились получать препараты антител, выработанных к одной антигенной детерминанте, т. е. препараты моноклональных антител. [8]
9. Системы ДНК-диагностики
Информация обо всем многообразии свойств организма заключена в его генетическом материале. Так, патогенность бактерий определяется наличием у них специфического гена или набора генов, а наследственное генетическое заболевание возникает в результате повреждения определенного гена. Сегмент ДНК, детерминирующий данный биологический признак, имеет строго определенную нуклеотидную последовательность и может служить диагностическим маркером.
В основе многих быстрых и надежных диагностических методов лежит гибридизация нуклеиновых кислот -- спаривание двух комплементарных сегментов разных молекул ДНК. Процедура в общих чертах состоит в следующем.
1) Фиксация одноцепочечной ДНК-мишени на мембранном фильтре.
2) Нанесение меченой одноцепочечной ДНК- зонда, которая при определенных условиях (температуре и ионной силе) спаривается с ДНК-мишенью.
3) Промывание фильтра для удаления избытка несвязавшейся меченой ДНК-зонда.
4) Детекция гибридных молекул зонд/мишень.
В диагностических тестах, основанных на гибридизации нуклеиновых кислот, ключевыми являются три компонента: ДНК-зонд, ДНК- мишень и метод детекции гибридизационного сигнала. [5]
9.1 Гибридизационные зонды
Чтобы обеспечить адекватность диагностического теста, гибридизационные ДНК- и РНК- зонды должны быть высокоспецифичными. Другими словами, необходимо, чтобы зонд гибридизовался только с искомой нуклеотидной последовательностью. Если есть вероятность получения ложноположительного (наличие гибридизационного сигнала в отсутствие последовательности-мишени) или ложноотрицательного (отсутствие сигнала при наличии последовательности-мишени) результата, то целесообразность применения теста значительно снижается. Специфичность зондов может проявляться на разных уровнях: они могут «различать» два и более вида, отдельные штаммы в пределах одного вида или разные гены. В зависимости от ситуации зонды могут быть представлены молекулами ДНК или РНК; они могут быть длинными (более 100 нуклеотидов) или короткими (менее 50 нуклеотидов), представлять собой продукт химического синтеза, клонированные интактные гены или их фрагменты.
Зонды получают разными способами. Один из них состоит в следующем. ДНК патогенного микроорганизма расщепляют с помощью рестрицируюшей эндонуклеазы и клонируют в плазмидном векторе. Затем проводят скрининг рекомбинантных плазмид с использованием геномной ДНК как патогенного, так и непатогенного штаммов. Те плазмиды, которые содержат последовательности, гибридизующиеся только с ДНК патогенного штамма, составляют основу видоспецифичных зондов. После этого проводят ряд дополнительных гибридизаций с ДНК, выделенными из различных организмов, чтобы удостовериться, что потенциальные зонды не дают с ними перекрестной гибридизации. Для определения чувствительности метода каждый из зондов проверяют также на модельных образцах, в том числе и на смешанных культурах.
Весьма желательно, чтобы ДНК-диагностику можно было проводить на исходном материале, без дополнительного его культивирования или выделения нуклеиновых кислот, особенно в тех случаях, когда тестируются клинические образцы. Исследователи с успехом проводят гибридизацию с ДНК-мишенями, присутствующими в образцах кала, мочи, крови, смывах из зева и в тканях без предварительной их очистки. Если концентрация последовательности-мишени в исследуемом образце слишком мала, ее можно амплифицировать с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). [6]
9.2 Нерадиоактивные методы детекции
В большинстве лабораторий для гибридизации используют зонды, меченные каким-либо радиоактивным изотопом, чаще всего 32Р. Такие зонды обладают высокой удельной радиоактивностью и обеспечивают хорошее отношение сигнал/шум. Радиоактивно меченный зонд наносят на фильтр с фиксированной на нем ДНК- мишенью, проводят гибридизацию, отмывают несвязавшуюся ДНК-зонд и детектируют метку с помощью радиоавтографии.
Однако 32Р является короткоживущим изотопом, испускающим высокоэнергетическое излучение; при работе с ним необходимо использовать специальное оборудование и обеспечивать безопасную утилизацию отходов. Чтобы обойти эти трудности, были созданы нерадиоактивные системы детекции. Для усиления гибридизационного сигнала в этом случае используется ферментативное превращение хромогенного или хемилюминесцентного субстрата: первый из них под действием фермента изменяет окраску, а второй испускает свет. В большинстве подобных систем применяются ДНК-зонды, содержащие биотинилированные нуклеотиды. Гибридизация и детекция сигнала проводятся более или менее стандартным образом.
1) Зонд, меченный биотином, гибридизуют с ДНК-мишенью (рис. 4, А).
2) Промывают фильтр для удаления избытка несвязавшегося зонда.
3) Добавляют авидин (белок куриного яйца) или стрептавидин (бактериальный аналог авидина) (рис. 4, Б).
4) Добавляют биотинилированный фермент -- щелочную фосфатазу или пероксидазу хрена (рис. 4, В).
5) В зависимости от используемого фермента добавляют хромогенный или хемилюминесцентный субстрат и регистрируют изменение окраски либо люминесценцию, сопровождающую превращение субстрата в продукт (рис. 4, Г).
Нерадиоактивные системы детекции обладают и другими преимуществами: биотинилированная ДНК остается стабильной при комнатной температуре как минимум год; методы регистрации хемилюминесненции обладают такой же чувствительностью, как и методы регистрации радиоактивного сигнала; детекция испускаемого света при помощи рентгеновской пленки или люминометра, как и регистрация изменения цвета, занимают несколько часов. [6]
Рисунок 4 - Нерадиоактивные методы детекции.
10. Биосенсорные устройства для медицинской диагностики
В настоящее время основными методами определения маркеров инфекционных заболеваний являются иммуноферментный анализ и полимеразная цепная реакция. Эти методы зарекомендовали себя как высокоспецифичные и чувствительные. Однако они имеют ряд недостатков - длительность постановки, отсутствие жесткого контроля качества тест-систем, возможность загрязнения исследуемых образцов ДНК или РНК, высокая стоимость реактивов и приборов. Методы, основанные на использовании нанобиотехнологий, позволяют преодолеть эти недостатки.
С этой точки зрения, среди нанотехнологических устройств наибольший интерес представляют системы на основе быстродействующих оптических биосенсоров, позволяющие выявлять белковые маркеры заболеваний в реальном времени.
Современные оптические биосенсоры характеризуются быстротой анализа - нескольких минут, возможностью определять константы равновесия и кинетические константы формирования и распада комплексов, время жизни комплекса, обладают высокой чувствительностью и легко роботизируются. Обычно сенсор состоит из следующих частей (рис.5).
Рисунок 5 - Принцип действия биосенсора.
Распознающий элемент (он также может быть назван рецепторным слоем) представляет собой вещество, которое способно селективно взаимодействовать с аналитом.
Трансдьюсер (англ. Transducer - преобразователь, датчик) преобразует химическое или биологическое взаимодействие в электрический сигнал.
Система сбора и обработки данных служит для усиления и анализа сигнала и отображения результатов. Необходимо отметить, что разработка сенсоров является междисциплинарной задачей, которая требует участия широкого круга специалистов: физиков, инженеров, химиков, биологов, врачей, экологов. Кроме очевидных требований, предъявляемых к новым сенсорам, таких как простота эксплуатации, дешевизна, высокая точность, селективность и скорость анализа, добавляются еще требования миниатюризации (это связано с развитием нанотехнологий), иногда возможность работать в непрерывном режиме, а иногда даже - возможность внедрения в человеческий организм. [17]
Заключение
Ежегодно в нашей стране миллионы людей сельскохозяйственных животных болеют различными инфекциями, в том числе острыми кишечными заболеваниями. Экономический ущерб от этих заболеваний огромен.
Одним из важных этапов борьбы с инфекциями является их ранняя диагностика. Наиболее длительным и трудоемким этапом микробиологического исследования при проведении лабораторной диагностики того или иного инфекционного заболевания является изучение биохимических свойств патогенных микробов. Каждый микроорганизм характеризуется специфическим спектром ферментов. Поэтому изучение биохимической активности микроорганизмов играет важную роль в лабораторной практике при идентификации микроорганизмов. Биохимическая активность положена в основу их классификации и всегда используется для установления родовой и видовой принадлежности выделяемых возбудителей.
Бурный научно-технический прогресс во всех областях знаний, в том числе и в области микробиологических исследований, сопровождается разработкой и созданием быстрых, простых и экономичных методов биохимической экспресс-индикации микроорганизмов.
Список использованных источников
1) Биотехнология /Под ред. Н.Е.Егорова и Самуилова - М., Высш.шк., 1987. - с. 543
2) Виестур У.Э., Шмитс И.А., Жилевич А.В. Биотехнология: Биологические агенты, технология, аппаратура. - Рига, Зинатне, 1987 - с. 169.
3) Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. -- МИА, 2005. -- с. 154-156.
4) Иммунобиологические препараты для профилактики, лечения и диагностики инфекционных заболеваний: учебное пособие / Под ред. Е.П. Красноженова, Т.Л. Мирютовой. Томск: Из-во «Печатная мануфактура», 2007. -с. 175-192.
5) Медицинская вирусология /Под редакцией Д.К. Львова. М.: Медицинское информационное агентство, 2008.-с. 24-38.
6) Медицинская микробиология, вирусология. Учебник /Под ред. А. А. Воробьева,- М.,2004. - с. 158.
7) Медицинская и санитарная микробиология - Воробьев А.А. - Учебное пособие, Высш.шк., 2003. - с. 543.
8) Промышленная микробиология: Учебное пособие /Под ред. Н.С. Егорова, - М.: Высшая школа, 1989. - с. 192.
9) Петров В. Иммунология -- СПб: "Лань", 1999. -- с. 57-65.
10) Поздеев О.К. Медицинская микробиология. Учебник для вузов/ Под ред. В.И. Покровского. - М.,2001.-с. 233.
11) Покровский В.В. Вич - инфекция. (Руководство по эпидемиологии инфекционных болезней. Т.2 ) М.,1993. -с. 278.
12) Руководство к практическим занятиям по медицинской микробиологии / Под ред. проф. Е.П. Красноженова.-Томск: Изд-во Том. ун-та, 2003.-260с.
13) Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии с основами асептики и биотехнологии /Учебное пособие /Под ред. Н.А.Заикиной, 2002. - с. 43.
14) Спирин А.С. Молекулярная биология. Структура рибосом и биосинтез белка.М.Наука.1986. - с. 245.
15) Теоретические основы биотехнологии. Методические указания к лабораторным занятиям. - Ленинград, 1989. - с. 92
16) Тутов И. К., Ситьков В. И. Основы биотехнологии ветеринарных препаратов // Учебное пособие для вузов. Ставрополь 1997. - с. 159-179.
17) Улавин В.П. и др. Задачи нанотехнологии - биосенсоры / В.П. Улавин, А.В.Степанов, П.Д.Дибилин, Ю.А.Соколинский // Российские нанотехнологии, 2010.- №3. - С.12-15.
18) Химическая энциклопедия / Под ред. Кнунянц.- М.:Советская энциклопедия, 1998. - т.2. - с. 232.
19) Ящур В.П. и др. Моноклональные антитела / В.П. Ящур, А.В.Юрин, П.Д.Самойлов, Ю.А.Попова // Биотехнология, 2006. - №4. - С.2-4.
20) www.chem.msu.su/rus/teaching/biotech/all.pdf
21) www.medi.ru
22) www.medkurs.ru
