рефератырефератырефератырефератырефератырефератырефератырефераты

рефераты, скачать реферат, современные рефераты, реферат на тему, рефераты бесплатно, банк рефератов, реферат культура, виды рефератов, бесплатные рефераты, экономический реферат

"САМЫЙ БОЛЬШОЙ БАНК РЕФЕРАТОВ"

Портал Рефератов

рефераты
рефераты
рефераты

Авидин-биотиновая реакция в иммуноанализе

Авидин-биотиновая реакция в иммуноанализе

Введение

В последние годы в качестве альтернативы радионуклидам в иммуноанализе нашли широкое применение неизотопные метки, в том числе ферменты, хемилюминесцентные соединения, флуорофоры и коллоидные частицы. Применение неизотопных маркеров затрудняется необходимостью синтезировать, очищать и охарактеризовывать белковые конъюгаты в случае каждого определяемого вещества. Ранее система авидин - биотин нашла широкое применение при локализации, обнаружении и очистке белков. Оказалось, что эта система не менее полезна и в иммуноанализе.

В работе детально рассмотрены два подхода, с помощью которых авидин-биотиновая реакция может быть использована в двухцентровом иммуноанализе. В обоих подходах применяли препараты иммобилизованных и биотинилированных антител. Эти препараты отбирали по принципу распознавания различных эпитопов антигена. В первом подходе сначала иммобилизованные антитела вводили в реакцию с исследуемым образцом и биотинилированными антителами. Затем добавляли конъюгат авидина или стрептавидина с ферментом или с хемилюминесцентным маркером. Во втором подходе вместо белкового конъюгата добавляли свободный авидин или стрептавидин и затем добавляли биотинилированный фермент. В обоих случаях определение осуществляли спектрофотометрически или по интенсивности люминесценции после добавления соответствующих субстратов. В качестве биотинилированных ферментов-маркеров применяли пероксидазу хрена, АВ+-зависимые ферменты, АТР-зависимые ферменты, пенициллиназу и щелочную фосфатазу. Рассмотрим некоторые результаты, полученные с помощью этих двух подходов.

Основные принципы

Уже давно известно, что для обеспечения сильного взаимодействия биотина с гликопротеином яичного белка авидином требуется только уреиднос кольцо витамина. Следовательно, карбоксильную группу остатка валериановой кислоты в биотине можно модифицировать и таким образом получать активные биотинилированные производные. В частности, биотин, связанный с макромолекулой, сохраняет способность связываться с активным центром авидина. Поскольку молекула авидина состоит из четырех идентичных субъединиц, то с ней могут быть одновременно связаны остатки биотина двух различных биотинилированных белков. Эти свойства авидии-биотинового комплекса широко используются для решения различных задач, в том числе 1) обнаружения, локализации и очистки белков, углеводов и нуклеиновых кислот; 2) разработки методов двухцентрового иммунометрического анализа; 3) картирования эпигонов в гибридомной технологии.

Практическое применение авидин-биотиновой системы ограничивается высокой основностью авидина и наличием в его молекуле углеводных остатков, что в свою очередь обусловливает высокий уровень неспецифического связывания. Более 20 лет назад в бактериях Streptomyces avidinii был обнаружен другой биотинсвязывающий белок, названный стрептавидином. Подобно авидину яичного белка, стрептавидин также образует очень прочный и специфический нековалент-ный комплекс с биотином и состоит из четырех идентичных субъединиц. Каждая субъединица содержит один биотинсвязываюший центр. В отличие от авидина стрептавидин негликозилирован и имеет нейтральную ph. Авидин и стрептавидин сильно различаются по аминокислотному составу, хотя оба богаты остатками триптофана. Некоторые свойства этих белков приведены в табл. 1.

Таблица 1. Некоторые характеристики авидина и стрептавидина

Характеристики

Авидин

Стрептавиднн

tМолекулярная масса

67 000

60 000

Мол. масса субъединицы

15 600

14 600 .

Kd (авидин-биотиновый комплекс), М

-10-15

-10-15

Еш (1 мг/мл)

1,54

3,4

Связывание биотина на субъединицу

1

1

Олигосахариды на субъединицу

1

0

Манноэа на субъединнцу

4-5

0

GlcNAc* ва субъединицу

3

0

Иэоэлектрическая точка, pi

>10

<7

Остатки аминокислот на субъеднницу

Триптофавы

4

8

Тироэины

1

6

Лиэины

9

4

Аргинины

8

4

Аспарагин + аспарагиновая кислота

15

12

Глутамин + глутаминовая кислота

10

9

Амиды

16

-

Стрептавидин можно использовать вместо авидина или в дополнение к нему в авидин-биотиновых системах. Он коммерчески доступен, и, подобно авидину, его можно очищать с помощью аффинной хроматографии на иминобиотиновой колонке. Поскольку бактериальный белок имеет нейтральную изоэлектрическую точку и не содержит углеводных остатков, то для него нехарактерны неспецифические взаимодействия, свойственные авидину яичного белка. Хотя неспецифическое связывание авидина можно свести к минимуму с помощью химических или каких-либо других методов, стрептавиднн и его конъюгаты являются наилучшим решением этой проблемы.

В лаборатории для разработки различных методов иммуноанализа применяются имеющиеся в продаже конъюгаты авидина с ферментами, а также синтезированные препараты биотинилированных белков и стрептавидина с хемилюминесцентной меткой.

Получение биотинилированных белков

Антитела и ферменты биотинилировали по ранее описанной методике с использованием N-гидроксисукцинимидных эфиров производных биотина с различной длиной алкильной цепи. Структура реагентов и схема реакции представлены на рис. 2. Качество полученных препаратов проверяли с помощью ELISA или двухцентрового иммунометрического анализа.

Получение белков с хемилюминесцентной меткой

Стрептавиднн или очищенные фракции IgG моноклональных антител обрабатывали сукцинимидными производными аминобутилэтилизолюминола. Полученные конъюгаты очищали гельфильтрацией на сефадексе G-25 и хранили при -20°С.

Методы анализа

При разработке методов двухцентрового иммунометрического анализа белков применяли меченые конъюгаты авидина или стрептавидина либо стрептавидин как связующее звено между биотинилированными антителами и биотинилированным ферментом. Величину сигнала в ферментативной реакции как в том, так и в другом случае определяли спектрофотометрически или по интенсивности люминесценции в зависимости от типа используемой метки.

Авидин и стрептавидин в качестве меченых зондов

Принципиальная схема этого метода представлена на рис. 3. Исследуемый образец инкубировали с высокоаффинными моноклональными антителами, ковалентно связанными с полистирольными шариками диаметром 6,5 мм. Затем в систему вводили биотинилированные антитела к другим эпитопам антигена. По завершении иммунологической реакции добавляли авидин, меченный ферментом, или содержащий хемилюминесцентную метку стрептавидин. В зависимости от используемого маркера измерение осуществляли спектрофотометрически или по интенсивности люминесценции.

Определение с помощью спектрофотометрии

Для изучения влияния длины цепи между молекулой биотина и моноклональным антителом на чувствительность анализа применяли систему, в которой избыток моноклональных аити-hGH антител был ковалентно связан с полистирольными гранулами. Гранулы инкубировали со стандартными препаратами или с пробами и с двумя различными препаратами биотинилированных моноклональных hGH-антител, различающимися длиной цепи, соединяющей молекулу биотина и антитела. По завершении реакции антиген - антитело в систему добавляли конъюгатавидин - щелочная фосфатаза и смесь инкубировали в течение 30 мин. Растворы упаривали в токе воздуха, добавляли субстрат м-нитрофенилфосфат и смесь инкубировали 45 мин при 37°С.

Образовавшийся продукт ферментативной реакции определяли по поглощению при 405 нм. Экспериментальные данные представляли в виде графика зависимости логарифма оптической плотности от логарифма концентрации hGH. Полученные данные свидетельствуют, что более крутой наклон наблюдается в случае антител клона №69, биотинилированных с помощью N-гидроксисукцинимидного эфира с длинной цепью CONH3-). Чувствительность анализа, достигаемая с длинноцепочечными биотинилированными антителами клона №69, сравнима с чувствительностью определения гормона с помощью обычного конкурентного РИА.

Определение путем измерения интенсивности люминесценции

Кроме спектрофотометрии для определения связанных биотинилированных антител мы также использовали измерение интенсивности люминесценции. На этом рисунке символом L обозначен хемилюминесцентный маркер, а моноклональные антитела к hGH биотинилировали через длинную цепочку CONH3-). В данном методе моноклональные антитела, связанные с полистирольными гранулами, инкубировали со стандартами или пробами и с длинноцепочечными производными биотинилированных антител анти-hGH при комнатной температуре.

По завершении иммунологической реакции добавляли стрептавидин, несущий хемилюминесцентную метку. Через 30 мин гранулы промывали. Интенсивность свечения связанной метки регистрировали при щелочном рН с использованием системы микропероксидаза - пероксид водорода. Калибровочный график зависимости логарифма интенсивности хемилюминесценции от логарифма концентрации hGH представлен на рис. 5. Предел обнаружения гормона с помощью данного метода составляет 3-10-5 м.ед. hGH/л или 1,5 пг в пробирке, а рабочий диапазон - от 4-10-5 до 10-1 м.ед. hGH/л. Коэффициент вариации анализа внутри серии равен 5,5%.

Нормальный уровень hGH и его динамические изменения при искусственной стимуляции у здоровых пациентов определяли с помощью обычного РИА и двухцентрового иммунометрического анализа. Коэффициент корреляции обоих методов составил 0,96. Кроме того, метод ИХМА позволил определить уровень базальной секреции и слабые изменения концентрации hGH в плазме крови у больных гипопитуитаризмом в течение циркадного цикла, что невозможно сделать с помощью обычного РИА. Полученные данные показывают, что люминесцентный ИХМА в 10 раз более чувствителен, чем существующие радио- и иммуноферментные методы определения hGH.

Стрептавидин и биотинилированные ферменты как зонды

Принципиальная последовательность операций в этом методе представлена на рис 7. Связанные с носителем и биотинилированные моноклональные антитела инкубировали с пробой или стандартами. По завершении иммунологической реакции последовательно добавляли или стрептавидин и биотинилированную щелочную фосфатазу, или ацетилированный авидин и биотинилированную глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу. В зависимости от фермента величину сигнала регистрировали спектрофотометрически или по интенсивности люминесценции. Примером такого подхода может служить определение hGH с помощью иммобилизованных на полистирольных гранулах моноклональных антител анти-hGH и модифицированных длинноцепочечным производным биотина антител анти-hGH клона №69. Гранулы отмывали и последовательно инкубировали при комнатной температуре со стрептавидином и длинноцепочечным производным биотинилированной щелочной фосфатазы. После промывки добавляли раствор j-нитрофенилфрсфата. Образование продукта регистрировали по поглощению при 405 нм. Калибровочный график для определения hGH, полученный с помощью биотинилированной щелочной фосфатазы и спектрофотометрического определения продукта ферментативной реакции, представлен на рис. 8.

Чувствительность анализа сравнима с чувствительностью методов типа РИА. Коэффициент вариации внутри серии при анализе смешанной плазмы с концентрацией hGH 7.6-10"3 м.ед./л равен 6,5%, а коэффициент вариации между сериями при анализе того же пула - 7,4%.

На рис. 9 приведены результаты анализа образцов плазмы, взятых у пациентов, подвергнутых тесту «на стимуляцию секреции гормона роста. Полученные данные свидетельствуют, что с помощью этого метода можно регистрировать и количественно определять реакцию в тестах по стимуляции и подавлению синтеза hGH, проводимых для оценки резервов гормона в гипофизе. Все применявшиеся в этом методе реагенты устойчивы в течение по меньшей мере двух лет. Диапазон калибровочной кривой позволяет определять в одном анализе высокие и низкие концентрации hGH.

Заключение

Сравнительные данные для двух методов двухцентрового иммунометрического анализа hGH приведены в табл. 2. Чувствительность использованного для сравнения метода РИА составляла 0,6-10-3 м.ед./л, а рабочий диапазон - 10-3м.ед./л.

рефераты
РЕФЕРАТЫ © 2010